Quelle est la différence entre un système PCR conventionnel et un système PCR en temps réel?


Réponse 1:

En bref, le principe est le même: vous avez deux amorces (FW et RV). Ils sont conçus contre une cible spécifique ou conçus pour se lier contre plusieurs cibles mais qu'ils ont en commun une séquence conservée.

Maintenant, en PCR en temps réel, l'utilisation d'amorces est couplée à un colorant fluorescent qui se lie au sein d'un ADN double brin (également connu sous le nom d'agent intercalant, comme SYBR Green) ou à des sondes qui portent avec elles un Fluorochrome et un Quencher. Les deux approches (si vous avez besoin de les connaître en détail je vais vous expliquer, mais ici je m'en tiendrai à la question principale) permettent de suivre l'amplification de la molécule d'ADN ciblée lors de l'étape d'amplification, en temps réel, fournissant à l'investigateur une analyse quantitative.

Pourquoi est-ce utile?

Que fait la PCR? Il amplifie. Chaque événement d'amplification est appelé cycle d'amplification. Habituellement, les cercles d'amplification sont maintenus en dessous des 30 cicle par réaction (entre 25 et 28). Pourquoi ça? Parce que la PCR est utilisée pour voir si quelque chose est là ou non, ou si quelque chose est là dans cet état plus ou moins par rapport à un contrôleur. Si les étapes d'amplification sont trop importantes, vous ne pourrez pas comprendre si quelque chose est vraiment là ou si vous voyez un signal simplement parce que vous le laissez amplifier tant de fois, de sorte que finalement il semble qu'il y ait quelque chose là-bas (attention, je m ne pas dire «quantifier» parce que la PCR standard rend impossible par sa nature de le faire).

Par exemple, A était inférieur à B. L'amplification commence et après 30 cycles, vous exécutez un gel et A et B ont tous deux un signal fort. Vous dites donc "A = B, il n'y a pas de différence entre contrôle et expérience". Cela ne serait pas arrivé si vous n'aviez fait que 25 cycles, par exemple, vous voyez ce que je veux dire?

Alors qu'avec la PCR en temps réel, vous pouvez voir cycle par cycle la quantité d'amplifcon (le brin amplifié) à ce moment-là pendant ce cycle spécifique. Donc, si vous exécutez 30 cycles, lorsque vous obtenez le résultat, en regardant le cycle d'amplification précédent, vous pouvez dire «ok la différence est réelle» ou «il n'y a pas de différence».

Il s'agit en fait du logiciel qui fonctionne. Vous avez un seuil (vous verrez donc le signal, seulement s'il est supérieur à une certaine quantité, il peut être fixé par le scitiste, en fonction de sa propre expérience du besoin). Et comme vous pouvez le voir, au-dessus de 30 cycles, le chiffre commence à se stabiliser. À ce stade, il ne sera pas possible de faire la distinction entre les choses, car elles se ressembleront toutes! Mais, le logiciel vous permet de parcourir tous les cycles et d'avoir un aperçu de ce qui s'est passé cycle par cycle.

J'espère que cela vous aidera, si vous avez besoin de plus de détails ou de clarifications, faites le moi savoir.


Réponse 2:

Vous ne l'avez pas demandé, mais je soulignerai qu'il existe un autre schéma de PCR quantitative qui gagne en popularité: la PCR numérique.

L'inconvénient de la PCR en temps réel est que vous ne pouvez pas obtenir de résultats vraiment quantitatifs sans exécuter des réactions contre les normes. Une des principales raisons en est que différents amplicons présenteront des efficacités d'amplification différentes, qui à leur tour peuvent être influencées par la variation des conditions de réaction (telles que la non-uniformité du contrôle de la température à travers la plaque de PCR) ou des contaminants de l'échantillon. La PCR numérique élimine ces problèmes en transformant la PCR en un système binaire: l'amplification est vue ou non.

La PCR numérique consiste à exécuter de nombreuses réactions de PCR en parallèle en utilisant le même matériel d'entrée. L'astuce est que l'échantillon est dilué de sorte que de nombreuses chambres de réaction ne devraient recevoir aucune molécule matrice. La PCR est exécutée puis le nombre de chambres positives est compté. Le branchement de cela dans des équations basées sur la distribution de Poisson donne une estimation du nombre de molécules d'entrée. Parce qu'il est basé sur le comptage, le nombre ne dépend pas d'une courbe standard; c'est un peu plus quantitatif.

Un certain nombre de systèmes de PCR numériques ont été commercialisés, utilisant des puits ou des gouttelettes pour les chambres de réaction. Ils diffèrent également par le nombre de chambres de PCR; les schémas de gouttelettes ont atteint des nombres beaucoup plus élevés. La précision et la plage dynamique sont toutes deux liées au nombre de gouttelettes - avec plus de chambres, vous pouvez être plus loin dans votre estimation de concentration initiale.

Les différents schémas offrent des coûts d'équipement différents et une facilité de flux de travail. Par exemple, l'appareil de Fluidigm est entièrement intégré, mais je pense qu'il offrait moins de 1000 chambres par échantillon, tandis que le système de BioRad a des étapes d'émulsification, d'amplification et de comptage distinctes (avec deux appareils dédiés; des cycles de thermocyclage dans un thermocycleur standard) et des dizaines de milliers de chambres.